Introduction

Grâce à une progressive standardisation des méthodes et au gain de sensibilité obtenu au cours des dernières années, les outils de la biologie moléculaire sont maintenant devenus indispensables dans la prise en charge des hépatites virales B et C. En effet, si les tests de détection sérologique des antigènes et des anticorps pour l’hépatite B, des anticorps anti-VHC par Elisa de 3e génération pour l’hépatite C, sont sensibles et spécifiques, la détection du génome viral est indispensable au moment du diagnostic et surtout de la prise en charge thérapeutique.

Nous aborderons successivement la place de la détection de l’ARN du VHC qualitatif et quantitatif et celle de l’ADN du VHB en fonction des différentes techniques utilisées. On rappellera toutefois qu’à côté de la détection du génome viral, les outils de la biologie moléculaire sont également utiles pour déterminer le génotype viral en particulier pour l’hépatite C et à terme devraient être aussi utilisés en routine pour étudier la prévalence des mutations sous l’effet des analogues de nucléosides comme cela a été démontré récemment pour la Lamivudine et les mutations YMDD dans l’hépatite B.

La détection de l’ARN du VHC dans le sérum

» Détection de l’ARN du VHC par méthodes qualitatives dans le sang

Les techniques de PCR qualitative sont aujourd’hui les techniques de détection de l’ARN du VHC les plus sensibles. La méthode la plus souvent utilisée est un test commercial (Amplicor HCV, Produits ROCHE) dont la sensibilité est environ 100 copies/ml ou 50 UI/ml. Ce test intègre un système de prévention des contaminations par les produits préalablement amplifiés (ou carryover) fondé sur l’utilisation de l’uracyl-N-glycosylase (UNG) et possède ainsi une spécificité satisfaisante. Le risque de faux-positifs par contamination croisée, est réduit lorsque le test est réalisé sur l’automate COBAS Amplicor [1-3].

Une autre technique a été récemment commercialisée. Elle s’appelle Transcription-Mediated Amplification ou TMA-Base HCV RNA testing [4]. Dans cette technique, l’ARN viral est hybridé avec des oligonucléotides complémentaires de la région 5′ non codante et un acide nucléique servant de contrôle interne qui est un des composants du réactif de capture et est hybridé de la même manière. Les acides nucléiques hybridés sont capturés sur des micro-particules magnétiques et l’amplification est réalisée à l’aide d’une ARN polymérase T7 qui va amplifier les régions conservées de la région 5′ non codante de l’ARN capturé et du contrôle interne. Les amplicons sont ainsi détectés en utilisant un test de protection d’hybridation qui utilise une sonde simple brin complémentaire des amplicons et marquée avec un signal chemiluminescent. La sensibilité de cette technique est d’environ 50 copies/ml, quel que soit le génotype soit environ 5 UI/ml.

» Indication de la détection qualitative de l’ARN du VHC dans le sang

La nomenclature des actes de biologie médicale autorise la détection qualitative du génome du VHC dans les indications suivantes [5, 6] : a) En cas de sérologie VHC positive : bilan pré-thérapeutique et évaluation de l’efficacité de la thérapeutique, diagnostic de l’infection chez un enfant né de mère infectée par le VHC, mise en évidence d’une réplication virale chez une personne ayant des transaminases normales de façon répétée, imputabilité du VHC au cours d’une hépatopathie ayant plusieurs causes possibles ;

b) En cas de sérologie VHC négative ou discordante : hépatopathie aiguë d’étiologie indéterminée après élimination des causes possibles d’hépatite (virale, toxique, médicamenteuse et métabolique), hépatopathies chroniques d’étiologie indéterminée après élimination des causes possible d’hépatite (virale, toxique, médicamenteuse et métabolique), en particulier sur certains terrains tels que sujets immunodéprimés, transplantés et hémodialysés, exploration d’une maladie systémique pouvant être associée au VHC, diagnostic précoce d’un risque de contamination après piqûre lors d’un prélèvement biologique ou d’une injection (si le sujet contaminant est infecté par le VHC ou a un statut sérologique inconnu).

» Détection de l’ARN du VHC par méthodes quantitatives

La quantification de l’ARN du VHC dans le sang fait appel à des techniques spécifiques qui peuvent se classer en deux groupes : les techniques d’amplification de la cible et les techniques d’amplification du signal. En pratique, en France, 2 tests sont actuellement commercialisés et largement utilisés pour la quantification de l’ARN du VHC [3, 5 ,7] :

a) l’un est fondé sur l’amplification de la cible : il s’agit d’une transcription inverse – PCR quantitative non compétitive (Amplicor HCV Monitor ) pour lequel il existe maintenant une version automatisée sur l’automate Cobas Amplicor évitant là encore le risque de contamination croisée.

b) L’autre est fondé sur l’amplification de signal par ADN branché et on dispose maintenant de la 3e génération du test VERSANT HCV RNA 3.0 Assay (bDNA). Ces deux tests associent une très large zone de linéarité avec une haute sensibilité analytique, ils possèdent une bonne reproductibilité et permettent de quantifier la charge virale quel que soit le génotype. La plupart des étapes de manipulations sont automatisées

et il existe une bonne corrélation entre les deux méthodes jusqu’à environ 5 105 UI/ml.

» Indication de la détection de l’ADN du VHC par PCR quantitative

La mesure de la charge virale VHC par test quantitatif n’a aucun intérêt pour l’épidémiologie ou apprécier la gravité de la maladie sauf peut-être après transplantation hépatique. C’est dans la prise en charge thérapeutique que la mesure de la charge virale doit trouver sa principale indication en pratique clinique. Elle doit absolument être réalisée avant de débuter un traitement, surtout pour les malades de génotype 1 pour lesquels on sait qu’il existe une différence de réponse thérapeutique, en tout cas par la bithérapie interféron standard et ribavirine selon le niveau de la charge virale. La limite, selon les différentes études entre charge virale basse et haute a été fixée à environ 2 000 000 de copies/ml ou 800 000 UI/ml. Chez les patients de génotype 1 ayant une charge virale < 800 000 UI/ml, la durée du traitement par bithérapie associant l’interféron standard 3 MUI 3 fois/semaine et la ribavirine peut être de 6 mois alors que la durée doit être portée à 12 mois si la charge virale est > 800 000 UI/ml [8]. Pour la bithérapie associant l’interféron pégylé et la ribavirine, on ne dispose pas encore actuellement des données nous permettant de conclure dans le même sens. La mesure de la charge virale pendant le traitement pourrait également être intéressante. En effet, plusieurs études ont montré la performance en terme de valeur prédictive positive et négative d’une virémie quantitative mesurée 12 semaines après le début du traitement par interféron pégylé associé à la ribavirine. Un seuil d’environ 400 000 copies/ml à 12 semaines pour la bithérapie standard et la variation d’au moins 2 logs de copies/ml pour l’interféron pégylé seul ou en association avec la ribavirine, sont actuellement les mieux évalués et pourraient être proposés dans le suivi thérapeutique [9, 10]. La conférence de consensus devrait, à ce sujet, donner des conclusions définitives. Après transplantation hépatique, il semble également qu’une charge virale élevée puisse être associée à une récidive précoce de la maladie voire au développement d’une hépatite fibrosante cholestatique et mérite donc d’être monitorée dans le suivi de ces patients.

D’autres techniques sont en cours de développement. Elles utilisent une méthodologie de PCR en temps réel : l’une utilise le TaqmanTM (Perkin Elmer) et l’autre le Light CyclerTM (Roche-Boehringer). Elles seront certainement les méthodes de quantification virale de demain car elles permettent de mesurer le nombre de copies produites durant la phase cinétique de la réaction de PCR [5, 11].

La détection de l’ADN du VHB dans le sérum

» Les méthodes de détection

La détection de l’ADN du VHB dans le sérum est indispensable pour apprécier la réplication virale au cours des examens pré-thérapeutiques et du suivi d’un traitement. Quatre tests commerciaux sont actuellement à notre disposition mais, malheureusement, il n’existe pas de standardisation des méthodes et il existe une variation de la sensibilité de ces tests [12-14]. Compte tenu que le virus de l’hépatite B circule dans le sérum à forte concentration (= 1010 virions/ml), les tests de biologie moléculaire directs sont capables de détecter l’ADN du VHB chez de nombreux patients, en particulier ceux qui ont une maladie active et la présence de l’antigène HBe dans le sérum. Ces tests usuels commerciaux, utilisent soit une hybridation en phase liquide (Genostics ; Abbott Laboratories North Chicago, IL), un test d’hybridation en phase solide (Digene HC II ; Digene Gaithersburg, MD) et un test d’amplification du signal (VERSANT, Bayer diagnostics, Emeryville, CA). La limite inférieure de sensibilité de ces différents tests, varie entre 105 et 106 copies/ml. Récemment, un test de PCR quantitative a également été développé, qui peut détecter l’ADN du VHB jusqu’à un taux inférieur de 102 copies/ml (Amplicor – Monitor HBV ; Roche Diagnostics, Plesington, CA). Ce test peut détecter l’ADN du VHB dans une grande majorité des cas, non seulement chez les patients atteints d’une hépatite virale chronique B à virus sauvage, mais également chez les patients ayant un pré-core mutant voire un portage asymptomatique du VHB [1, 15]. Il est à noter qu’aucun de ces tests n’a été approuvé aux USA et tous sont limités par la standardisation. Ainsi, le test Genostics donne des taux d’ADN du VHB qui sont 10 à 80 fois inférieurs à ceux de la technique d’ADN branché et 10 à 20 fois inférieurs que ceux de l’essai du test Digene. On devrait également disposer prochainement d’un test b-DNA dit de 3e génération ayant une sensibilité équivalente et une linéarité supérieure à celle de la PCR et d’un test utilisant la méthode dite » Transcription Mediated Amplification » ou TMA également très sensible [16]. Il est à noter aussi que, comme pour l’hépatite C, les techniques utilisant une méthode de PCR en temps réel sont en cours de développement avec la méthodologie Taqman(Perkin Elmer) ou celle utilisant le Light Cycler TM (Roche Boehringer) permettant d’abaisser le seuil de sensibilité probablement à 10 copies/ml [17-21]. Le EuroHep Pathobiologic Group a récemment établi 2 échantillons de plasma référent provenant de porteurs du VHB et ayant déterminé aussi précisément que possible le nombre de molécules d’ADN du VHB dans ces échantillons [22]. Ces deux échantillons seront donc très utiles pour la standardisation des tests et les contrôles de qualité des essais thérapeutiques.

» Les indications

La détection de l’ADN du VHB dans le sérum par une technique d’hybridation moléculaire classique (Genostics Abbott ou Digene Murex) ou par un test d’amplification du signal, permet le diagnostic et le suivi de la majorité des hépatites virales chroniques B à virus sauvage HBs et HBe positif. Avant traitement, l’ADN du VHB est positif par cette méthode dans plus de 95 % des cas. Au moment de la séroconversion HBe sous traitement et pendant le suivi post-thérapeutique, la recherche de l’ADN viral par cette méthode est toujours négative [23]. L’arrivée récente des nouveaux analogues de nucléosides comme la Lamivudine ou l’Adéfovir dipivoxil pose un autre problème. En effet, d’abord la séroconversion HBe apparaît moins durable et stable que celle constatée après traitement par interféron alpha et d’autre part la survenue fréquente d’une mutation dans le génome viral appelé YMDD après un an de traitement ou plus, justifie l’utilisation de techniques plus sensibles comme la PCR pour la détection de l’ADN du VHB [24-27]. La reprise d’une réplication virale identifiée par la technique PCR apparaît en effet précocement par rapport à l’activité sérique des transaminases ou la détection de l’ADN du VHB par une technique d’hybridation moléculaire classique [26]. La détection de l’ADN du VHB par une technique sensible apparaît également indispensable pour authentifier la présence d’une réplication virale chez les patients porteurs d’une hépatite virale chronique B à virus pré-core mutant et pour le suivi thérapeutique de ces malades car dans la majorité des cas, la réplication virale est plus faible, inférieure au seuil de détection des techniques d’hybridation moléculaire classique [28]. Enfin, il n’existe pas pour l’instant de seuil permettant de discriminer les porteurs asymptomatiques du virus de l’hépatite B ou porteurs sains des hépatites virales chroniques B à virus pré-core mutant. Des travaux récents ont suggéré qu’une charge virale en PCR de l’ordre de 105 ou de 5.104 pourrait avoir une valeur discriminante [29, 30] mais ces résultats doivent être confirmés par des études ultérieures. Il est possible également que la recherche de l’ADN du VHB par une méthode PCR soit utile pour le diagnostic des hépatites B dites » occultes « , survenant chez des patients sans antigène HBs avec présence de l’anticorps anti-HBc +/- associé à l’anticorps anti-HBs. Des travaux récents ont en effet montré que dans ce cas, la présence de l’ADN du VHB par une méthode PCR dans le sang et / ou dans le foie pouvait être associée à une maladie plus sévère chez des patients atteints d’hépatite C [31-33], voir des malades avec une hépatopathie de cause indéterminée [34]. Ces résultats devront être également confirmés.

En résumé

La détection de l’ ARN du VHC par PCR qualitative est indispensable pour poser le diagnostic d’une hépatite virale chronique C. La détection de l’ARN du VHC par PCR quantitative est indispensable avant de débuter un traitement surtout chez les patients de génotype 1 et ce, afin de déterminer la durée de ce traitement. Après trois mois de traitement, la détection de l’ARN du VHC par PCR quantitative pourrait également être utile car la diminution d’au moins 2 Logs de copies/ml semble avoir une bonne valeur prédictive négative de réponse à la thérapeutique. Ces résultats récemment publiés devront être validés par la conférence de consensus.

La détection de l’ ADN du VHB par une méthode conventionnelle est indispensable au moment du diagnostic et avant de débuter un traitement chez un malade ayant une hépatite virale chronique B à virus sauvage. Le suivi doit comporter au moins une détection de l’ADN du VHB par cette méthode tous les 3 mois. La détection du l’ADN du VHB par une méthode plus sensible (PCR ou bDNA 3.0) semble maintenant s’imposer dans les situations suivantes : 1) chez les malades ayant un virus sauvage, traités par analogues de nucléosides au moment et après la séroconversion HBe. 2) chez les malades ayant une hépatite virale chronique B à virus pré-core mutant avant et pendant le traitement de façon à en apprécier l’efficacité thérapeutique et surveiller l’apparition d’une éventuelle mutation YMDD dans le gène de la polymérase. Enfin, la place de la détection de l’ADN du VHB par PCR pour discriminer un porteur inactif du VHB et une éventuelle hépatite virale chronique B » occulte » reste à déterminer.

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